铜绿假单胞菌怎么杀死(铜绿假单胞菌S8脂肪酶酶学性质及固定化研究?)
近年来，由于煤炭、石油、天然气等能源的短缺和环境保护的需要，生物柴油作为石化柴油的替代能源已成为研究热点。生物柴油是由长链脂肪酸和低碳醇组成的脂肪酸酯。)，原料可再生，排放低，易生物降解，是一种环保燃料。目前，商用生物柴油主要采用化学法生产，即利用高强度的酸或碱催化剂将动植物油和甲醇制成4 ~ 6种。该方法具有酯交换反应速度快、转化速率高、成本低的优点，但也存在能耗高、污染环境的缺点。
脂肪酶在非水条件下具有良好的酯交换能力，已用于酶法合成生物柴油的研究。该方法具有反应条件温和、产物易于分离回收、醇用量少、无污染、对对原料要求低等优点，但在酶法生产生物柴油的过程中，酯交换反应中通常用作酰基受体的短链醇(如甲醇)容易导致脂肪酶失活，反应副产物甘油对脂肪酶的活性也受到负面影响。针对对，合成生物柴油研究中存在的问题，从东营， 山东胜利油田长期受石油污染的土壤中筛选出一株对产甲醇脂肪酶有较高耐受性的铜绿假单胞菌S8，在此基础上，以铜绿假单胞菌S8为出发菌株，采用摇瓶发酵法生产脂肪酶，并对对发酵产粗脂肪酶液的性质和固定化进行了研究，为生物酶法合成生物柴油的应用奠定基础。1材料和方法
1.1材料铜绿假单胞菌S8:在本实验室进行筛选和保存。
发酵培养基(克/升):葡萄糖8，酵母粉8，花生油20，(NH4)2SO4 6，硫酸镁7H2O 1，KH2PO4 1，pH 7.0。1.2方法
1.2.1粗脂肪酶液的制备将铜绿假单胞菌S8菌株在摇床中培养72小时，以10 000转/分钟的速度离心10分钟，并收集发酵液的上清液。向上清液中加入硫酸铵至25%饱和度，在4下静置5 h，在4下以10 000 r/min离心10 min，弃去沉淀物，收集上清液，向上清液中加入硫酸铵至75%饱和度，收集沉淀物；将沉淀物用去离子水溶解，透析得到S8菌株的粗酶液，冷冻干燥得到脂肪酶粗粉。1.2.2脂肪酶的活性通过经典的聚乙烯醇橄榄油乳液法11测定。酶活性单位的定义：在温度37、酸碱度7.0的条件下，每分钟催化脂肪水解产生1 mol游离脂肪酸所需的脂肪酶量为一个脂肪酶活性单位(U)。
1.2.3耐甲醇性考察：向粗酶液中加入最终体积分数为3%的甲醇溶剂，在4下放置6、12、24、48、72 h，然后测定脂肪酶活性。以不含甲醇溶剂的原始酶溶液为对1 . 2 . 4脂肪酶的酶学特性，计算对酶活性
脂肪酶的最适温度及其热稳定性的其它测定条件不变，分别在20、25、30、35、40、45、50、55和60测定脂肪酶活性，最高酶活性为100%，计算各温度下的相对酶活性，确定脂肪酶的最适温度；将脂肪酶在30、35、40和45下孵育，每隔0.5 h测定一次酶活，以未孵育的酶液的酶活为100%，计算相对酶活，确定酶的热稳定性。
以邻苯二甲酸氢钾-咪唑(pH 4.2~8.2)缓冲液和甘氨酸-氢氧化钠(pH 8.6~10.6)缓冲液为缓冲体系，测定脂肪酶的最适pH值和pH稳定性。将一定量的粗酶液与等体积的不同酸碱度的缓冲液混合，调节至酸碱度为4.2 ~ 10，在4下储存24 h，然后测定剩余酶活，最高酶活为计算相对酶活的100%，以此测定酶活
1.2.5脂肪酶的固定硅胶的活化：将硅胶干燥1 g，加入20毫升丙酮和10%(体积比)硅烷，混合均匀，在50磁力搅拌2小时。抽滤，用蒸馏水洗涤3 ~ 5次，在60烘箱中干燥2小时。向干燥的硅胶中加入1毫摩尔/升磷酸盐缓冲液20毫升，ph值为7，25% 戊二醛，2ml，在20活化2小时。然后，将活化的硅胶过滤，用蒸馏水洗涤
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